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常見技術問題

PCR擴增產物的檢測分析

發布日期:2014-12-27閱讀次數:4604

PCR擴增反應完成之后,必須通過嚴格的鑒定,才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產物。凝膠電泳是檢測PCR產物常用和最簡便的方法,能判斷產物的大小,有助于產物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳,前者主要用于DNA片段大于100bp者,后者主要用來檢測小片段DNA。
1.瓊脂糖凝膠電泳
這是實驗室最常用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由于泳動速度不同而被分離,經溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。
用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。
    (1)制膠
瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來,過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時,加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻后倒板(注意排除氣體)。
(2)加樣和電泳
上樣時一般取PCR反應液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負極向正極移動。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。
(3)檢測
將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現,并與擴增時所設的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照,判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。
它與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優點:①分辨率很強,可達1bp;②能裝載的DNA量大,達每孔10μgDNA;③回收的DNA純度高;④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2~5倍;⑤避免了EB迅速退色的弱點,銀染的凝膠干燥后可長期保存。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍:

聚丙烯酰濃度(%
有效分離范圍(bp
溴酚蘭位置(bp
二甲苯青FF位置(bp
20
6~100
12
45
15
25~150
15
60
12
40~200
20
70
8
60~400
45
160
5
80~500
65
260
3.5
100~1000
100
460

(1)制膠
在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。
制備適量合適濃度的凝膠,使之略多于膠板。制備100μl體積凝膠的配制方法見下表。
 
不同濃度(%)聚丙酰胺凝膠的制法:

試劑
3.5%
5%
8%
12%
20%
30%丙烯酰胺溶液(ml
11.6
16.6
26.6
40
66.6
水(ml
67.7
62.7
26.6
40
66.6
5×TBEml
20
20
20
20
20
10%過硫酸銨(ml
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
TEMEDml
0.035
0.035
0.035
0.035
0.035

在加入TEMED和10%過硫酸銨后,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內,完全注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,待30-60分鐘膠聚合后,取下膠板,放入電泳槽中固定。
(2)加樣和電泳
上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側孔中加入標準分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm電壓電泳,電泳時間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時關閉電源,將膠片取出。
(3)銀染
分開兩塊玻璃板,將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min,雙蒸水洗3次,每次2min,然后將凝膠片轉入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min,吸去AgNO3液,用雙蒸水洗3次,每次30s,加入100ml顯色液約7-10min,待DNA帶顯示清除時,吸去顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出凝膠觀察。
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