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常見技術問題

PCR反應條件的選擇及優化

發布日期:2014-12-27閱讀次數:3458

    PCR技術已經在生物學研究和臨床醫學檢驗領域中得到了廣泛的應用,PCR技術也日臻完善。PCR技術操作簡便,特異性強,敏感度極高,正因為敏感度高,很容易受其他因素的影響,因此要得到準確可靠的反應結果,需根據不同的模板,摸索最適合的條件,配制出PCR反應試劑。
    聚合酶鏈反應必須具備下述基本條件:①模板核酸(DNA或RNA),②人工合成的寡核苷酸引物,③合適的緩沖體系,④鎂離子,⑤三磷酸脫氧核苷酸,⑥耐熱DNA聚合酶,RNA反轉錄酶及RNA酶抑制劑(RNasin),⑦溫度循環參數(變性、復性和延伸的溫度與時間及循環次數)。
1.模板的選擇
    PCR反應用DNA(單、雙鏈DNA)或RNA都可以作模板進行核酸的體外擴增。若起始材料是RNA,須先通過逆轉錄得到cDNA后才能進行正常PCR擴增。核酸標本來源廣泛,可以從純培養的細胞或微生物中直接提取,也可以從臨床標本(血、尿、便、痰、體腔積液、漱口水等)、犯罪現場標本(血斑、精斑、毛發等)、病理標本(新鮮或固定石蠟包埋標本)以及木乃伊標本中提取。無論標本來源如何,待擴增核酸都需部分純化,以使核酸樣品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白質。雖然PCR可以僅用微量樣品(甚至是來自單一細胞的DNA),但為保證反應的特異性,一般還宜用納克級(ng)的克隆DNA、微克水平的染色體DNA或102-105拷貝的待擴增DNA片段做起始材料。
2.引物
    PCR擴增產物的大小及擴增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的。因此,引物的選擇與合成對PCR成功與否具有決定性意義。對某一DNA片段來說,由于同源順序的存在,隨意設計的兩條引物鏈,其PCR產物經電泳分析時可能會出現多條電泳帶。因此,在引物的設計過程中要考慮引物鏈的特異性,即它們只與被檢測的DNA片斷互補。
(1)    引物長度以16-30個堿基為宜,最佳20-24個bp,不會形成穩定的復合體。
(2)    有時引物不起作用,理由不明,可以移動序列位置來解決。
(3)    (G+C)%含量一般40%-60%為佳,兩個引物中(G+C)%含量應盡量相似。
(4)    兩個引物之間不應發生互補,特別是在引物3’端避免形成“引物二聚體”。如無法避免,其3’端互補不應大于2個堿基。應盡量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列,避免同源序列(尤其6個以上相同)。
(5)    引物內部避免形成次級結構,尤其是發卡結構,必要時應通過計算機進行結構分析。
(6)    引物濃度不宜偏高,濃度過高有兩個弊端,一是易形成引物二聚體,二是當擴增微量靶目標并且起始材料又不太純時容易產生非特異性產物。一般來說,用低濃度引物不僅經濟,反應特異性也較好。
3.鎂離子濃度
    Mg2+濃度對PCR擴增反應的特異性和產量有著顯著影響。PCR中常用的體系應Mg2+濃度為1.5mmol/L,但對不同的反應體系應優化Mg2+濃度。濃度過高,使反應特異性降低;濃度過低,使產物產量減少。PCR反應中Mg2+的加入量要比dNTP濃度高0.5-2.5mmol/L。最好對每種PCR反應體系Mg2+量的優化。另外,還需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合劑影響游離Mg2+的濃度。
4.三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)
    PCR反應中每種dNTP的終濃度為50-200μmol/L,在此范圍內,擴增產物量、特異性與合成忠實性這間的平衡最佳,dNTP濃度過低必然影響擴增產量,過高則會導致錯誤摻入,其濃度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量還受其他因素的影響,所以不同反應體系中dNTP的最佳濃度不盡相同。
5、TapDNA聚合酶
    在其他參數最佳時,每100μl反應液中含1-2.5u Taq DNa酶。然而酶的需要量可以根據不同的模板分子或引物而變化,當優化一種PCR反應體系時,最好在每100μl體積中加入0.5-5u酶的范圍內試驗最佳酶濃度。如酶濃度太高,會出現非特異性擴增,而過低時,則擴增產量太低。另外不同來源的Taq DNA酶、測定條件和單位定義的不同、生產廠家產品品質的優劣,這些都是使用Taq酶時需要考慮的因素。
6.溫度循環參數
    變性溫度通常為94℃左右,主要取決于擴增片段的長度和(G+C)的比例,達不到變性溫度致使變性不完全,是導致PCR失敗的常見原因。變性時間一般為30-60秒,時間太長不但沒有必要反而會因降低酶的活性而影響產量和反應特異性。常用PCR一般為20-40個周期,隨著周期次數增加TaqDNA聚合酶活性降低,聚合時間延長,引物或單核苷酸減少等原因,會造成反應后期容易發生錯誤堿基摻入。所以在滿足產物得率的前提下,應盡量減少周期次數。
7.石蠟油
    加入石蠟油的目的是防止反應液蒸發,以免造成反應體積和成分的改變,特別是當反應體積小或反應條件嚴格時更應注意。反應中加入的石蠟油必須是高質量的,無菌的,不能含有抑制PCR反應中各種試劑活性的污染物,加入的體積要求不太嚴格,應以蓋住反應液液面為度。
8.平臺效應
    “平臺效應”是指PCR后期循環產物累積趨于飽和,使原來以指數增長的速率變成平坦的曲線,同時出現非特異產物的大量增加的現象。下列因素可能與平臺效應有關:
(1)dNTP或引物的消耗量。
(2)反應物的穩定度(dNTP或酶)
(3)最終產物的阻化作用(焦磷酸鹽、雙鏈DNA)。
(4)非特異產物或引物二聚體與反應物的競爭。
(5)產物在高濃度時變性不完全,影響引物的延伸。
(6)酶與PCR產物的結合,使酶分子減少。
    合理的PCR循環參數,能最大限度地避免這些因素對產物擴增的影響。
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